枳实—白芍药对干预肝郁脾虚型IBS大鼠的配伍及药动学研究

【摘要】目的：肠易激综合征,简称IBS,属胃肠道功能紊乱性疾病,枳实-白芍药对是建立在对肝郁脾虚型IBS基本病机的理解上,结合长期的临床实践总结制定的经验药对,它具有疏肝解郁和调理肝脾,主要用于肝郁脾虚型IBS的治疗。本论文通过对枳实-白芍药对配伍后化学成分变化、药理效应改变、量效关系、体内外吸收、代谢和排泄变化与配伍规律等方面进行系统的研究,探讨药对发挥药效作用的最佳配伍比例、量效和时量关系,阐明枳实-白芍药对配伍干预肝郁脾虚型IBS大鼠的影响,以期为发挥枳实-白芍药对治疗肝郁脾虚型IBS的疗效及其临床应用提供科学依据。方法：1.枳实-白芍药对配伍的化学成分研究针对枳实-白芍药对化学成分的复杂性,应用全方HPLC统一分析方法,并对色谱流动相,检测波长,色谱柱温度和流速等色谱条件进行优化,建立枳实和白芍高效液相色谱指纹图谱,提取10批枳实和10批白芍样品色谱图,建立共有模式,进行相似度分析、聚类分析和主成份分析,以评价枳实和白芍样品质量的优劣,指导枳实和白芍药材的筛选。采用HPLC波长切换法对枳实-白芍药对中4个有效成分一黄酮类(柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷)和芍药苷进行定量分析。以枳实黄酮类和白芍芍药苷含量为指标,采用多指标综合评分法和高效液相色谱法,确定枳实-白芍药对干预肝郁脾虚型IBS大鼠的最佳配伍比例及其最佳煎煮方法。纯化枳实总黄酮和白芍芍药苷,提取有效部位/成分,为后期药动实验奠定基础。2.枳实-白芍药对不同配比的药效学研究设计枳实-白芍药对1：1,1：2和2：1三个不同配伍比例,以胃肠道作用、镇痛作用和行为学作用等相关指标,对枳实-白芍药对不同配比的药理效应进行比较研究。胃肠道实验研究以小肠推进率、24h粪点数和腹部回缩反射阈值作为药效指标,研究不同配比的枳实-白芍药对对肝郁脾虚型IBS大鼠的胃肠道作用。镇痛实验研究运用热板镇痛和扭体镇痛法,考察不同配比的枳实-白芍药对对正常小鼠的镇痛效应。行为学实验研究运用旷场试验,考察不同配比的枳实-白芍药对对肝郁脾虚型IBS大鼠的抗抑郁效应。3.枳实-白芍药对配伍的化学成分及肝郁脾虚型IBS大鼠的胃肠药效相关性研究采用乙酸灌肠与束缚夹尾相结合的方法建立肠易激综合征大鼠模型,以小肠推进率、24h粪点数和腹部回缩反射阈值作为药效指标,获得药效学相关数据,同时对不同配伍比例和不同煎煮方法的枳实-白芍药对,进行HPLC测定,并将HPLC图谱中11个色谱共有峰与药效指标进行灰色关联度相关性分析和偏最小二乘回归分析,探讨枳实-白芍药对配伍中化学成分与其干预肝郁脾虚型IBS大鼠的胃肠药效之间的相互关系。4.枳实-白芍药对有效部位/成分在大鼠体内、体外药代动力学研究(1)枳芍散(枳实-白芍药对1：1)中有效部位/成分在正常大鼠和肝郁脾虚型IBS大鼠体内药代动力学过程研究建立并应用大鼠血浆样品处理方法及HPLC-MS/MS分析条件,检测枳芍散水煎液中黄酮类成分和芍药苷的入血量,并应用药代动力学软件DAS2.1计算各成分的药代动力学参数(AUC、Tmax、T1/2、Cmax、CL、MRT0-t,),比较正常大鼠和肝郁脾虚型IBS大鼠中枳实-白芍药对有效成分的药代动力学差异。(2)肠道菌群对枳实-白芍药对有效部位/成分的代谢作用采用大鼠的新鲜粪便37-C厌氧培养,经乙酸乙酯萃取后采用HPLC法对代谢成分进行分离和分析,研究枳实-白芍药对不同配比组(1：1、1：2、2：1)及其单味药的有效成分分别在正常大鼠和肝郁脾虚型IBS大鼠肠道菌群中的代谢和药代动力学参数差异,阐明药代动力学规律和配伍影响。(3)枳实-白芍药对有效部位/成分在大鼠尿液和粪便中的排泄研究建立并应用大鼠尿液和粪便样品处理方法及HPLC分析条件,检测大鼠排泄物中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、柚皮素和芍药苷的含量,比较枳实-白芍药对的有效成分在大鼠排泄中的差异和配伍影响。结果：1.枳实-白芍药对配伍的化学成分研究建立了高效液相色谱波长切换法测定枳芍散(枳实-白芍药对1：1)水煎液中4个有效成分(芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷),以SyncronisC18(4.6mm×250mm,5um)色谱柱,0.3%磷酸水溶液-乙腈为流动相,二元梯度洗脱,流速1.0mL·min-1,检测波长为230nm(0～30min)测定芍药苷、283nm(30～60min)测定柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷。该方法准确可靠、重复性好,可用于枳实-白芍药对的质量控制。确定枳实总黄酮的纯化工艺为上样液浓度为3.5mg/mL,pH为6.0,上样量为18mL,静置吸附后用30mL的蒸馏水洗脱除杂,洗脱速率为60mL/h,再用72mL的88%乙醇洗脱,枳实总黄酮经纯化后纯度为79%；确定白芍芍药苷的纯化工艺为吸附时间1h,乙醇浓度80%,洗脱用量80mL,芍药苷的解析率91.78%。该纯化工艺简单,结果可靠。建立枳实和白芍药材的HPLC指纹图谱,发现在所考察的产地中,江西产枳实最优。并对枳实-白芍药对进行了归峰和比对,11个共有峰指认了其中4个色谱峰。结合药效学实验,确定枳实-白芍药对最佳配伍比例为1：1,与古方枳芍散的比例吻合。枳芍散(枳实-白芍药对1：1)的最佳煎煮方法为加入10倍量蒸馏水,浸泡30min,煎煮40min,煎煮两次。2.枳实-白芍药对不同配比的药效学研究胃肠道实验研究通过对肝郁脾虚型IBS大鼠进行胃肠道药效实验,发现不同配比的枳实-白芍药对可以显著减少大鼠排便数量,增加体重增长率以及降低小肠推进率。在大鼠的腹部回缩反射评分实验中,发现在20、40、60、80mmHg的扩张压力下,模型组的腹部回缩反射评分显著高于空白组,而各治疗组与模型组比较,大鼠腹部回缩反射评分均显著降低,表明枳实-白芍药对能降低IBS大鼠的内脏神经高敏感性。镇痛实验研究在热板实验中,发现枳实-白芍药对可延长小鼠舔后足的潜伏期；在醋酸扭体实验中,枳实-白芍药对能显著减少小鼠扭体反应的次数；热板实验和扭体实验结果表明不同配伍的枳实-白芍药对均具有镇痛作用,但作用强度与配伍比例有关。行为学实验研究模型组大鼠旷场总分较正常组明显减小；给药白芍或枳实-白芍1：2后大鼠旷场总分均较模型组明显增加,枳实-白芍1：1组中央区域停留时间最短,说明枳实-白芍药对能显著改善模型组大鼠的抑郁行为。3.枳实-白芍药对配伍的化学成分及肝郁脾虚型IBS大鼠的胃肠药效相关性研究HPLC图谱中的11个共有峰中,1、2、3、5、7、8、9(柚皮苷)、10(橙皮苷)、11(新橙皮苷)号峰与IBS大鼠的小肠推进率、24h粪点数、腹部回缩反射阈值有高度关联性(关联度>0.80),根据灰色关联度大小确定各峰对药效指标的贡献度,发现其中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷及部分未知化学成分贡献较大,并使用偏最小二乘法拟合得到各峰峰面积与药效间的数理方程。4.枳实-白芍药对有效部位/成分在大鼠体内、体外药代动力学研究(1)枳芍散(枳实-白芍药对1：1)中有效部位/成分在正常大鼠和肝郁脾虚型IBS大鼠体内药代动力学过程研究采用HPLC-MS/MS法比较枳实-白芍药对有效部位/成分在正常和肝郁脾虚型IBS大鼠血浆中的药代动力学规律。用DAS2.1药代动力学软件分别计算4个有效成分的药代动力学参数,得到正常大鼠血浆中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和芍药苷的AUC0-∞(μg·h/L)依次是723±190、782±201、4403±2044、11670±2769；MRT0-t(h)依次是6.1±0.97、7.8±1.0、12.6±2.4、7.2±0.38；T1/2(h)依次是1.9±0.63、4.6±3.6、13.2±6.4、2.9±0.99；Tmax(h)依次是2.2±0.82、3.4±2.2、2.5±1.1、3.4±0.73；Cmax(μg/L)依次是340±228、158±73、632±232、1220±345：CLZ(L·kg-1·h-1)依次是8.8±2.1、8.2±2.3、1.7±0.99、0.51±0.12。肝郁脾虚型IBS大鼠血浆中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和芍药苷的AUC0∞-(μg·h/L)依次是1229±374、1446±493、7757±3101、13508±6142；MRTo_t(h)依次是8.4±1.1、7.3±4.2、10.6±0.78、8.8±0.67；T1/2(h)依次是1.8±0.16、4.5±4.7、9.9±3.7、2.4±1.4;Tmax(h)依次是1.1±0.38、1.3±0.27、1.5±0.44、8.3±5.7；Cmax(μg/L)依次是349±256、673±556、1455±454、963±317；CLz(L·kg-1·h-1)依次是5.4±1.9、4.5±1.3、0.93±0.47、0.58±0.36。结果显示4个有效成分在正常与模型大鼠体内的动力学过程均符合二房室模型,经过统计软件分析发现,柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷在肝郁脾虚型IBS大鼠体内入血吸收均明显高于正常组,然而芍药苷体内吸收受到的影响不显著,表明三个黄酮苷在肝郁脾虚型IBS大鼠体内吸收显著性增加,有助于提高临床疗效。(2)肠道菌群对枳实-白芍药对有效部位/成分的代谢作用给药后,发现枳实-白芍药对配伍后柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷在正常大鼠和IBS大鼠肠道菌群中,代谢均受到抑制；而芍药苷在正常大鼠肠道菌中代谢加快,在肝郁脾虚型IBS大鼠肠道菌群中代谢遭到抑制。各配伍组中,枳实-白芍1：1组各有效成分的代谢最快。同时还发现肝郁脾虚型IBS大鼠肠道菌群对枳实-白芍1：1组各有效成分的降解速度和程度较正常大鼠肠道菌群增大,代谢存在差异,表明肝郁脾虚型IBS大鼠肠道菌群失调,影响枳实-白芍药对的代谢和生物转化,从而影响药效。(3)枳实-白芍药对有效部位/成分配伍变化对大鼠排泄的影响在对灌胃给药大鼠24h尿液和粪便分析中显示,粪便中能检测到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芍药苷和橙皮素、柚皮素；尿液中能检测到橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素和柚皮素。枳实-白芍药对配伍有利于三个黄酮苷和芍药苷的排泄率,但降低了两苷元(橙皮素、柚皮素)的排泄率,因此,配伍有助于提高橙皮素和柚皮素的生物利用。总体来说,三个黄酮苷和芍药苷经尿粪途径排出体外的量不多,苷元形式(橙皮素、柚皮素)排除体外的量所占比例大于苷类(柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷)。结论：1.枳实-白芍药对配伍的化学成分研究建立了全方HPLC统一分析方法,并进行了方法学考察,证明该方法稳定、可靠和重现性好。选择柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和芍药苷作为质控指标和工艺优化指标具有一定的科学性,同时进一步明确枳实-白芍药对的化学物质基础,探讨了该药对的配伍机制。2.枳实-白芍药对不同配比的药效学研究结果表明枳实-白芍药对能够明显抑制肝郁脾虚型IBS大鼠的小肠推进率,降低肝郁脾虚型IBS大鼠内脏敏感性,并具有镇痛和抗焦虑作用。以上药效结果表明枳实-白芍药对对肝郁脾虚型IBS大鼠具有干预作用。3.枳实-白芍配伍中化学成分变化及药效相关性研究发现枳实-白芍药对改善肝郁脾虚型IBS大鼠胃肠道病理状况,与其所含的多种化学成分相关,并为芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷作为部分质控、工艺优化指标和药效物质基础提供了科学依据。4.枳实-白芍药对有效部位/成分在大鼠体内、体外药代动力学研究建立了枳实-白芍药对水煎液给药后,大鼠血浆、尿液和粪便中有效成分浓度的一系列检测方法和各生物样品的预处理方法,方法稳定可控,重现性好,能够较准确的检测枳实-白芍药对水煎液中各有效成分的入血量、入尿量和入粪量,结果发现枳实-白芍药对不同配伍引起的排泄动态变化与肠道菌代谢动态过程呈正相关,本论文从吸收、代谢和排泄的角度证实了枳实-白芍药对配伍的合理性。并对正常和肝郁脾虚型IBS大鼠灌胃枳芍散后,有效成分的吸收入血和代谢过程进行比较,发现正常与模型组的药代动力学参数存在显著性差异,枳芍散黄酮类成分在肝郁脾虚型IBS大鼠体内有更好的生物利用度,为优化临床给药方案提供了科学依据。总之,本论文在中医药学理论和实践的指导下,跨学科地运用了中药学、药理学、统计学和计算机技术等现代科技手段,进一步明确了枳实-白芍药对干预肝郁脾虚型IBS大鼠的药效物质基础和配伍机制,为枳实-白芍药对的临床应用提供了实验依据。
【作者】陈稚；
【导师】江滨；
【作者基本信息】广州中医药大学，中药学，2014，博士
【关键词】肝郁脾虚型IBS；枳实-白芍药对；配伍；药动；量效关系；

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